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酿酒酵母表达体育网工程十博体育官网Pa-AMP05 的最新活性研究
新闻來源:【管理员】    发布时间:2018-07-22   浏览次数:3412

[摘要] 本实验采用琼脂扩散和稀释法,对体育网得到的体育网工程十博体育官网Pa-AMP05 的最新活性进行研究,结果表明,十博体育官网Pa-AMP05 具有较强的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活性,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为15.625 μg/mL,对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为31.25 μg/mL;且其浓度与最新活性呈线性正相关。

[关键词] 体育网工程十博体育官网;OD600值;最低抑菌浓度;最新活性;线性回归

十博体育官网在体外可直接杀灭病原微生物,具有广谱最新活性:不仅可以抗革兰氏阳性菌(G+)、革兰氏阴性菌(G-)和真菌、原虫等多种病原微生物,还可以抗肿瘤和癌细胞,甚至可以直接杀灭流感、疱疹等有包膜的病毒,是宿主防御外界病原体入侵的重要分子屏障。目前十博体育官网已在医药、体育网防腐、化妆品及动物养殖领域等应用。体育网工程最新Pa-AMP05 为酿酒酵母分泌型表达,主要存在于体育网液的上清液中,具有多项免疫功能(王凯等,2009a,b;皮灿辉等,2008)及较高的稳定性,且动物试验表明,其可以显著促进动物生产性能和健康水平(李永新等2009,罗治华等,2009)。本实验通过琼脂扩散法、微量稀释法和常量稀释法,对其最新活性进行研究,以此确证体育网工程十博体育官网Pa-AMP05 的高效最新性能。

1、 材料与方法

1.1 实验材料

体育网工程十博体育官网Pa-AMP05体育网液(十博体育官网含量:500 μg/mL)由十博体育网_十博体育官网_十博体育官网最新网站提供。指示菌大肠杆菌ATCC25922与金黄色葡萄球ATCC29213 由华南农业大学兽医学院提供。

1.2 实验方法

1.2.1 体育网工程十博体育官网Pa-AMP05 体育网过滤液的制备
吸取10 mL 的体育网工程十博体育官网Pa-AMP05体育网液原液分装到离心管,10000r/min离心10min,经孔径为0.22μm无菌滤膜过滤,备用。

1.2.2 大肠杆菌和金黄色葡萄球的制备
将大肠杆菌和金黄色葡萄球接入LB 液体培养基中,37℃培养,使其菌数达到1×109 CFU/mL,备用。

1.2.3 琼脂扩散法
参照药敏试验中琼脂打孔扩散法,把金黄色葡萄球菌和大肠杆菌原菌液浓度调至1×105 CFU/mL,将细菌均匀涂布到LB 培养基上,将灭菌的不锈钢小管(外径为5 mm)放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用灭菌针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。
加样:1号和2号孔分别加入体育网过滤液,阳性(+)孔加入抗生素(100μg/mL Zeocin,Invitro-gen)、阴性(-)孔加入空载体酵母体育网过滤液,各加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37 ℃温箱中培养15 h后,观察抑菌结果并测量抑菌圈直径。

1.2.4 微量稀释法检测十博体育官网最新活性

①最小抑菌浓度(MIC)的测定
把已培养好的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌原菌液用LB液体培养基稀释到1000倍(1×106 CFU/mL)。
在96孔板每个孔加入空白LB液体培养基100μL。根据设计的实验浓度,在第一列加入100μL待测样品,吸取100μL至第二孔,上下吹打,混合均匀后吸取100μL至第三孔,第4耀8孔操作相同,最后100 μL 弃去。这样每孔对应的体积分数为1、1/2、1/4、1/8。第9 孔和第10 孔分别做阳性对照(青霉素钠)和阴性对照(灭菌水)。抗生素(青霉素钠200μg/mL)操作方法同上。最后在每孔中加入100μL稀释好的菌液,放入恒温培养箱中过夜培养。

②结果判断
以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含最新物质)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时,应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔,则不应报告结果,需重复试验。

1.2.5 常量稀释法检测十博体育官网最新活性

参照药敏试验中常量肉汤稀释法,略有改动。

①培养物的制备及培养检测
按照不同稀释比例:1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 配置含有体育网过滤液的LB 液体培养基,分为7 个平行管,其中3管按1%接种量接入大肠杆菌,另3管按1%接种量接入金黄色葡萄球菌,同时留一管作为对照管,不接菌种。以无菌水与2 倍浓度LB培养基按1颐1 混合溶液作为阴性对照,以无菌水为检测OD600值所用参比样品。将以上所有试管封口后放入37℃的恒温摇床(250 r/min)里培养12h,检测其OD600值。

②最新活性的检测
终OD600值=样品OD600值-相应消除管OD600值。

③十博体育官网浓度与最新活性的线性关系测定
将检测得到的终OD600值与十博体育官网体育网过滤液稀释倍数做线性回归分析,根据R2值判断二者是否具有线性关系,以此证明十博体育官网浓度与最新活性的线性关系。

2、数据与结果

2.1 琼脂扩散法检测体育网工程十博体育官网Pa -AMP05 最新活性

实验发现,十博体育官网对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑菌效果。其对金黄色葡萄菌的抑菌圈直径大小为12mm,与抗生素阳性对照(100μg/mL Zeocin)相同。对大肠杆菌的抑菌圈大小为15mm ,与抗生素阳性对照(100μg/mL Zeocin)相同。

2.2 微量稀释法检测体育网工程十博体育官网Pa -AMP05 最新活性
通过微量稀释法检测出十博体育官网及青霉素钠的MIC值,结果见表1 所示。

表1 微量稀释法检测体育网工程十博体育官网Pa-AMP05最新活性

注:肉眼测试:很清亮用“-”表示;略微浑浊但没有达到阴性对照浑浊程度用“+”表示;与阴性对照浑浊程度一样用“++”表示。其中,抗生素为青霉素钠200μg/ml,十博体育官网体育网液中十博体育官网Pa-AMP05的含量为500μg/L。


结果测得青霉素钠对金黄色葡萄球菌的MIC值为:3.125μg/mL,对大肠杆菌的MIC值为:25μg/mL。十博体育官网对金黄色葡萄球菌MIC值均为15.625μg/mL,对大肠杆菌的MIC值均为31.25μg/mL。

2.3 常量稀释法检测体育网工程十博体育官网Pa -AMP05 最新活性

结果见表2。结果表明,以体育网工程十博体育官网体育网过滤液的稀释倍数为横坐标,分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养液的OD600 值为纵坐标,做线性回归分析,结果如图1、2。结果表明,回归方程分别为y=0.0206x-0.0952,R2=0.967;y=0.0051x+0.0234,R2=0.9749,即十博体育官网浓度与最新活性呈一定的线性正相关关系。

表2 常量稀释法检测体育网工程十博体育官网Pa-AMP05最新活性
 

注:其中OD600值均为消除培养基颜色影响后的结果,阴性对照(大肠杆菌)OD600=1.692,阴性对照(金黄色葡萄球菌)OD600=1.995,P<0.05。



 


体育网工程十博体育官网Pa-AMP05浓度与大肠杆菌最新活性的线性关系



体育网工程十博体育官网Pa-AMP05浓度与金黄色葡萄球菌最新活性的线性关系


3、结论

目前,琼脂扩散法、微量稀释法和常量稀释法为常用的最新活性检测方法,通过测定发现,体育网工程十博体育官网Pa-AMP05具有较强的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活性,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为15.625μg/mL,对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为31.25μg/mL;同时检测的青霉素钠对金黄色葡萄球菌的MIC值为:3.125μg/mL,对大肠杆菌的MIC值为:25μg/mL。通过线性回归分析表明,体育网工程最新Pa-AMP05的浓度与抗金黄色葡萄球菌活性呈一定的线性正相关关系。本试验中由于十博体育官网Pa-AMP05对大肠杆菌的MIC值低于对金黄色葡萄球菌的MIC值,做回归方程所选取的数据,稀释倍数最高达到64倍,远远高于十博体育官网Pa-AMP05对大肠杆菌的MIC值范围,导致回归方程截距为负值,但是这并不影响其线性关系的判断,即十博体育官网Pa-AMP05的最新活性强弱可以反映出体育网液中十博体育官网浓度的高低。此试验结果说明,体育网工程十博体育官网Pa-AMP05对所选取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性,具有广谱的抗细菌性能。


本篇重点摘录

通过琼脂扩散法、微量稀释法和常量稀释法检测十博体育官网Pa-AMP05的最新活性,发现:
1.体育网工程十博体育官网Pa-AMP05的浓度与抗金黄色葡萄球菌活性呈一定线性正相关关系。

2.由于十博体育官网Pa-AMP05对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC值)低于对金黄色葡萄球菌MIC值,做回归方程选取的数据,稀释倍数最高达64倍,导致回归方程截距为负,但不影响其线性关系的判断,即十博体育官网Pa-AMP05的最新活性强弱可以反映出体育网液中十博体育官网浓度的高低。

3.体育网工程十博体育官网Pa-AMP05对所选取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性,具有广谱的抗细菌性能


 


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